Автоматизированная витрификация крио

Nature Communications, том 13, номер статьи: 2985 (2022) Цитировать эту статью

5449 Доступов

5 цитат

13 Альтметрика

Подробности о метриках

Скорость и эффективность сбора данных и обработки изображений в криоэлектронной микроскопии возросли за последнее десятилетие. Однако методы подготовки криообразцов отстают, и необходимы более быстрые и воспроизводимые устройства для подготовки образцов. Здесь мы представляем устройство витрификации с высокоавтоматизированной обработкой образцов, требующее лишь ограниченного взаимодействия с пользователем. Кроме того, прибор позволяет проверять тонкие пленки с помощью световой микроскопии, поскольку избыток жидкости удаляется посредством отсасывания трубками, а не промокательной бумагой. В сочетании с контролем точки росы это обеспечивает контролируемую и воспроизводимую подготовку тонких пленок. Преимущество заключается в том, что качество приготовленного криообразца оценивается до получения данных электронной микроскопии. Практичность и производительность устройства иллюстрируются экспериментальными результатами, полученными путем витрификации белковых суспензий, липидных везикул, бактериальных и человеческих клеток с последующей визуализацией с использованием анализа одиночных частиц, криоэлектронной томографии и криокоррелированной световой и электронной микроскопии.

Криофиксация в стекловидной воде (аморфный лед) путем быстрого замораживания биологических образцов может обеспечить почти идеальную структурную сохранность биологических образцов, таких как белковые суспензии, вирусы, бактерии и эукариотические клетки. Криофиксация требует достаточно высокой скорости замораживания (> 100 000 ° C / с), чтобы предотвратить образование льда (кристаллов). В результате вода переходит в стеклоподобное аморфное метастабильное переходное состояние1. Используя витрификацию, структуру белков и клеток можно сохранить в их естественной гидратированной среде с атомарным разрешением. Остеклованные образцы совместимы с вакуумными условиями, необходимыми для криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ), а также могут быть изучены с помощью оптической криофлуоресцентной световой микроскопии (криофлуоресцентной световой микроскопии)2. Корреляционная световая и электронная микроскопия (CLEM)3 объединяет преимущества ЭМ (высокое разрешение, структурный контекст) с преимуществами широкого спектра доступных методов световой микроскопии (живое изображение, универсальная маркировка)4,5.

Было показано, что витрификация посредством замораживания с использованием жидкого этана или смеси этана и пропана в качестве криогенного материала6 является практическим подходом для криоподготовки биологических образцов толщиной до 10 микрон1,7. Для крио-ЭМ суспензии очищенных белков и вирусов сохраняются в тонких слоях воды размером в несколько десятков нанометров, на основе которых можно определить реконструкции атомного разрешения с помощью SPA8,9. Для витрификации также подходят более крупные структуры, такие как бактерии и прикрепившиеся клетки толщиной до нескольких микрон. Трехмерные реконструкции с молекулярным разрешением можно получить с помощью криоэлектронной томографии (крио-ЭТ) образцов толщиной примерно до половины микрона10,11. Минимизация толщины слоя жидкости важна, поскольку среда, окружающая образец, рассеивает электроны, увеличивая фоновый шум на изображениях, тем самым снижая соотношение сигнал/шум на изображениях и уменьшая достижимое разрешение в результирующих трехмерных реконструкциях.

Важный этап создания тонкого слоя жидкого образца на носителе образца для электронной микроскопии для ЭМ (обычно дырявый углеродный слой, поддерживаемый медной сеткой диаметром 3,05 мм) является проблематичным, поскольку тонкие слои воды по своей природе нестабильны и не позволяют точно контролировать Толщина слоя воды затруднена. Было обнаружено, что придание пленке-подложке гидрофильности с помощью тлеющего разряда на воздухе или в алкиламине12,13 помогает сформировать тонкий слой жидкости на пленке-подложке, а насыщенная влажностью среда помогает стабилизировать этот тонкий слой. В настоящее время общепринятой практикой является нанесение нескольких микролитров раствора образца на опорную пленку тлеющего разряда с последующим удалением излишков жидкости с помощью фильтровальной бумаги, которую затем замораживают методом погружения14,15.